游戏剧情是发生在《超凡蜘蛛侠》（2012）电影的几个月之后，彼得·帕克和格温·史黛西偷偷潜入了奥斯科普的禁区，在那里，格温怀疑，Oscorp可能会继续进行克特·康纳斯博士的跨物种实验，康纳斯之前已经变成了可怕的蜥蜴。他们被新的Oscorp主管阿利斯泰尔·斯米特(Alistair Smythe)抓住了，他证实了格温的怀疑，尽管跨物种携带了强大的病毒，并将被处理。然而，跨物种的所有人都对彼得的存在作出反应，这是一个跨物种的自我，并爆发了，感染了所有的科学家，包括Smythe和Gwen，在这个过程中。Smythe释放了他的安全机器人，这些机器人被编排来保护他们免受跨物种的攻击。彼得很快穿上了蜘蛛侠的衣服，让被感染的人被隔离，在过程中击退了机器人，摧毁了S-01却无法阻止跨物种和病毒逃入城市。

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